Q：提取過(guò)程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長(zhǎng)期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對(duì)提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來(lái)的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過(guò)高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過(guò) DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過(guò)經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對(duì)于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對(duì)上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會(huì)明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過(guò)添加適量的檸檬酸鈉來(lái)改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過(guò)量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會(huì)使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲(chǔ)存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。
